產品描述

Protein A磁珠為直徑200nm的納米磁珠，表面共價結合大量重組Protein A蛋白。納米級磁珠由于高的表面積與體積比，會提供更多結合位點，磁珠使用量更少，非特異性吸附率低。重組Protein A 蛋白更適合于結合mouse IgG2a, IgG2b, IgA, rabbit IgG, 以及human IgG1, IgG2 和IgG4。本產品廣泛應用于細胞裂解液、細胞培養上清、血清、腹水等樣品中的抗原免疫沉淀（IP）或免疫共沉淀（Co-IP）。

訂購信息

運輸與保存

藍冰運輸。4℃保存，有效期24個月。注：避免凍融或離心磁珠。

技術參數

使用方法

（一）樣本制備

對于貼壁細胞樣品：

1. 移除培養基，用PBS洗滌細胞兩次。

2. 收集細胞至1.5 mL EP管內，按比例加入IP Lysis/Wash Buffer，同時加入PMSF等相應的抑制劑，混勻后置于冰上靜置5-20min，期間需多次輕輕翻轉混合以促進細胞裂解。

3. 在4°C條件下，12000-16000g，10 min離心收集上清液，置于冰上以備后續實驗，或存放于-80°C長期保存。

表1.培養皿IP Lysis/Wash Buffer推薦使用體積

對于懸浮細胞樣品：

1. 在4°C條件下，500-1000g，10min，收集細胞，棄上清。

2. PBS重懸細胞，4℃，500-1000g，10 min，收集細胞，棄上清。

3. 用預冷的IP Lysis/Wash Buffer重懸細胞。每50 mg細胞使用500μL IP Lysis/Wash Buffer。同時加入PMSF等相應的抑制劑，混勻后置于冰上靜置5-20 min，期間需多次輕輕翻轉混合以促進細胞裂解。

4. 在4°C條件下，12000 -16000g，10 min離心收集上清液，置于冰上以備后續實驗，或存放-80℃長期保存。

對于血清樣品：

通常建議使用IP Lysis/Wash Buffer將血清樣品稀釋至目標蛋白的最終濃度介于50至150 µg/mL。稀釋后的樣品可置于冰上以備用，或存放于-20℃以便長期保存。

（二）免疫復合物的制備

以下實驗方案針對 2-10ug 親和純化的抗體，根據需要可以按比例放大。

1.   在離心管中將每個樣品的細胞裂解液與2-10ug 免疫沉淀抗體結合。每個免疫沉淀反應推薦的總蛋白量為500-1500ug。

2.   用IP Lysis/Wash Buffer將抗體以及制備好的樣品稀釋至 300-500μL。

3.   在室溫下旋轉孵育1-2 h, 或 4℃ 2-4 h，以形成抗體和目標蛋白的免疫復合物。

注：樣品所需的量和孵育時間均依賴于每個特定的抗體和抗原體系，因而可能需要優化，以達到效果；建議使用相應的同種亞型抗體對照，以便在你的抗體免疫沉淀中顯示特異性結合。

（三）免疫沉淀

注：為保證磁珠均勻分布，使用前通過反復顛倒或輕微渦旋混勻瓶中磁珠。

1.   將25-50µL Protein A磁珠加入1.5 mL離心管中。

2.   向磁珠中加入500 µL預冷PBS，輕柔混勻，使用磁力架分離磁珠，棄去上清。

3.   向離心管中加入200-500 µL IP Lysis/Wash Buffer，顛倒離心管數次或輕微渦旋混勻1min。用磁力架分離磁珠，棄去上清。

4.   將抗原樣品/抗體免疫復合物加入裝有磁珠的離心管中，混勻儀上室溫孵育1-2 h，或 4℃，2-4 h。

5.   用磁力架分離磁珠，除去未結合的樣品，并保存以備分析。

6.   向離心管中加入1000 µL IP Lysis/Wash Buffer，輕柔混勻5-10min，收集磁珠，棄上清。再重復洗兩次。

7.   變性洗脫：向離心管中加入80-100 µL SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（1×），將樣品置于100℃水浴或者金屬浴中加熱10 min。通過磁力架分離磁珠，收集含有目的抗原的上清進行后續實驗。注：當使用的一抗檢測分子量在50或25kDa范圍內的蛋白質時，建議使用構象特異性二抗進行檢測，以盡量減少抗體重鏈或輕鏈的干擾；如需保持蛋白活性，也可采用以下洗脫方式：

低pH洗脫：此方法為非變性洗脫法，洗脫的樣品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。向離心管中加入100 µL 洗脫液（0.1M ，pH2.5），混勻在室溫下孵育離心管5-10 min。接著置于磁力架上靜置約30s，待磁吸后，收集上清至新的Ep管，并立即加入20 μL的中和緩沖液（1M Tris-HCl，pH8.0），將洗脫產物pH調節至中性，樣品用于后期功能分析。

注意事項

1.   本產品于科學實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領域。

2.   請勿高速離心、干燥或冷凍磁珠，這些操作會導致磁珠聚集而降低結合能力。

3.   在免疫共沉淀（IP）實驗中，不同類型的抗體與其對應抗原之間的親和力可能有所不同，并且這種結合效率還可能受到IP Lysis/Wash Buffer的影響。若當前實驗步驟未能獲得理想結果，建議調整操作細節或自行篩選及配制適合的緩沖液，也可使用李記生物相關試劑，詳見底部。

4.   Protein A、Protein G和Protein A/G與不同種類的免疫球蛋白（Ig）及其亞類的結合強度表，請詳見

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本產品于科學實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領域。