產品描述

活性氧（Reactive oxygen species, ROS）包括超氧自由基、過氧化氫、及其下游產物過氧化物和羥化物等，參與細胞生長增殖、發育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程。李記生物的活性氧檢測試劑盒（Meilun Reactive Oxygen Species Assay Kit）是一種基于熒光染料DCFH-DA (2,7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate) 的熒光強度變化，定量檢測細胞內活性氧水平的方法。

DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，進入細胞內后，可以被細胞內的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細胞膜，從而使探針很容易被標記到細胞內。在活性氧存在的條件下，DCFH被氧化生成熒光物質DCF，綠色熒光強度與細胞內活性氧水平成正比，檢測DCF的熒光就可以知道細胞內活性氧的水平。在激發波長502 nm，發射波長530 nm附近，使用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、熒光分光光度計、熒光酶標儀、流式細胞儀等檢測DCF熒光，從而測定細胞內活性氧水平。

本試劑盒背景低、靈敏度高、線性范圍寬、使用方便，可用于各種真核培養細胞的檢測，且提供了活性氧陽性對照試劑Rosup，便于活性氧的檢測。以 6 孔板為例，每孔加樣量為1mL時，本試劑盒可測定約 100 次，96孔板約為1000次（每孔100μl）。

訂購信息

產品組分

運輸與保存

藍冰運輸。-20℃避光保存，有效期12個月。

使用方法

一、裝載探針

刺激時間較短（通常為2 h以內）的細胞：先裝載探針，后用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞。

刺激時間較長（通常為6 h以上）的細胞：先用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞，后裝載探針。

1.     原位裝載探針（僅適用于貼壁細胞）

(1)   細胞準備：檢測前一天進行細胞鋪板，確保檢測時細胞匯合度達到50~70%。【注】：必須保證細胞狀態健康，且檢測時不會過度生長。

(2)   探針準備：探針裝載前按照1:1000 用無血清培養液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μM。

(3)   探針裝載：吸除細胞培養液，加入適當體積稀釋好的DCFH-DA 工作液。加入的體積以能充分蓋住細胞為宜，【例】：6 孔板通常不少于1000 μL；96 孔板通常不少于100 μL。37℃細胞培養箱內避光孵育20~30 min。

(4)   細胞清洗：用無血清培養液洗滌細胞3 次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。

(5)   藥物誘導：加入適量經合適的緩沖液或無血清培養基稀釋到工作濃度的藥物，于37℃細胞培養箱內避光孵育，具體誘導時間根據藥物本身特性，以及細胞類型來決定。

(5)（可選）陽性對照：先用無血清培養基等1:1000 稀釋陽性對照（Rosup, 50mg/ml）到常用工作濃度100 μg/ml，加入細胞，一般37℃避光孵育20~30 min 可顯著看到活性氧水平提高，但依細胞類型會有比較明顯差異。（如，HeLa 細胞孵育30 min；MRC5人胚胎成纖維細胞1.5 h）

2.     收集細胞后裝載探針（適用于貼壁細胞和懸浮細胞）

(1)   細胞準備：按照標準方法培養細胞，必須保證檢測用細胞狀態健康。按照適當方法，清洗并收集足量的細胞。

(2)   探針準備：探針裝載前，按照1:1000 用無血清培養液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μM。

(3)   探針裝載：細胞收集后懸浮于加入適當體積稀釋好的DCFH-DA 工作液，使其細胞密度為1.0×106~2.0×107/mL，37℃細胞培養箱內避光孵育20~30 min，每隔3-5 min 顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。【注】：細胞密度需根據后續的檢測體系，檢測方法，以及檢測總量來進行調整。【例】：對于流式分析，單管檢測內細胞數目不少于104，也不可多于106。

(4)   細胞清洗：用無血清培養液洗滌細胞3 次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。

(5)   藥物誘導：將細胞懸浮于適量經合適的緩沖液或無血清培養基稀釋到工作濃度的藥物中，或把細胞等分成若干份后進行藥物刺激，于37℃細胞培養箱內避光孵育，具體誘導時間按藥物本身特性，以及細胞類型來決定。

(5)（可選）陽性對照：先用無血清培養基等1:1000 稀釋陽性對照（Rosup, 50mg/ml）到常用工作濃度100 μg/ml，加入細胞，一般37℃避光孵育20~30 min 可顯著看到活性氧水平提高，但依細胞類型會有比較明顯差異。（如，HeLa 細胞孵育30 min；MRC5人胚胎成纖維細胞1.5 h）

二、檢測

原位裝載探針法：激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細胞后用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測。

收集細胞后裝載探針：用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測，也可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。

三、參數設置

使用488 nm 激發波長，525 nm 發射波長，實時或逐時間點檢測刺激前后熒光的強弱。DCF 的熒光光譜和FITC 非常相似，可以用FITC 的參數設置檢測DCF。DCF 的激發光譜和發射光譜參考下圖。

四、其他事項說明

1.     陽性對照Rosup通常按照1:1000的比例使用。通常刺激后20~30 min可以觀察到顯著的活性氧水平升高。對于不同的細胞，活性氧陽性對照的效果可能有較大的差別。如果在刺激后30 min內觀察不到活性氧的升高，可延長誘導時間或適當提高活性氧陽性對照的濃度。如果活性氧升高得過快，可縮短誘導時間或適當降低活性氧陽性對照的濃度。

2.     對于某些細胞，若沒有刺激的陰性對照細胞熒光也比較強，可以按照1:2000～1:5000稀釋DCFH-DA，使裝載探針時DCFH-DA 的濃度為2～5 μM。探針裝載的時間也可以根據情況在15～60 min內適當進行調整。

3.     活性氧陽性對照（Rosup）僅僅用于作為陽性對照的樣品，并不是在每個樣品中都需加入活性氧陽性對照。

注意事項

1. 本產品于科學實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領域。

2. 探針裝載后，一定要洗凈殘余的未進入細胞內的探針，否則會導致背景較高。

3. 探針裝載完畢并洗凈殘余探針后，可以進行激發波長的掃描和發射波長的掃描，以確認探針的裝載情況是否良好。DCF 的激發光譜和發射光譜請參考上頁圖譜。

4. 盡量縮短探針裝載后到測定所用的時間（刺激時間除外），以減少各種可能的誤差。

本產品于科學實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領域。