JC-1 線粒體膜電位檢測試劑盒

產(chǎn)品描述

線粒體膜電位（ΔΨm）降低是細(xì)胞早期凋亡的關(guān)鍵標(biāo)志。這種膜電位的下降源于線粒體膜通透性的改變，主要由促凋亡蛋白（如 Bax 二聚體形成以及 Bid、Bak、Bad 的激活）誘導(dǎo)線粒體外膜形成孔隙所致。伴隨這些蛋白的激活，細(xì)胞色素 C 會(huì)從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。

JC-1 是一種廣泛應(yīng)用于檢測 ΔΨm 的理想熒光探針，適用于細(xì)胞、組織或純化線粒體樣本。其檢測原理基于膜電位依賴性的熒光狀態(tài)轉(zhuǎn)換：在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1 聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí) JC-1 為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光。通過 JC-1 從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測到膜電位的下降，同時(shí)也可以用 JC-1 從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變作為細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)檢測指標(biāo)。

JC-1單體的最大激發(fā)波長為 510 nm，最大發(fā)射波長為527 nm；JC-1 聚合物的最大激發(fā)波長為 585 nm，最大發(fā)射波長為 590 nm。這款試劑盒操作簡單快速，可以通過流式細(xì)胞儀，熒光顯微鏡或熒光酶標(biāo)儀檢測。

訂購信息

產(chǎn)品組分

運(yùn)輸與保存

藍(lán)冰運(yùn)輸。-20℃避光保存，有效期36個(gè)月。注：B組份也可以放4℃保存；為避免反復(fù)凍融，A與C組分建議分裝。

光譜特性

Ex/Em：    510/527 nm（單體物，綠色）              585/590 nm（聚合物，紅色）

使用方法

1.試劑準(zhǔn)備：

使用前請將產(chǎn)品瞬時(shí)離心至管底，再進(jìn)行后續(xù)操作。

（1）配制 JC-1 工作液：按如下方案配置1mL 1×JC-1染色工作液：先取10 µL 100×JC-1染色液，加入到890 µL滅菌的ddH₂O中，渦旋混勻，再向上述混合液中加入100 µL 10× Assay Buffer，渦旋混勻，即可得到1×JC-1染色液。

注：① 配置體積可同比例擴(kuò)大或縮小。②JC-1(100× in DMSO)在較低溫度情況下會(huì)凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可以 20-25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。③工作液配置完成后，一定要及時(shí)孵育細(xì)胞，避免工作液產(chǎn)生沉淀。

（2）配制1× Assay Buffer：用 ddH₂O 按 9：1 稀釋檢測緩沖液（如1 mL 10×assay buffer + 9 mL ddH₂O）。

2. 染色

開始實(shí)驗(yàn)之前，請確保JC-1和CCCP溶液已恢復(fù)至室溫。

(1)     按實(shí)驗(yàn)所需，在培養(yǎng)板中接種細(xì)胞（懸浮細(xì)胞不要超過10⁶個(gè)/mL）。

(2)     陽性對照組：根據(jù)培養(yǎng)基的量加入相應(yīng)體積50 mM的CCCP溶液（如終濃度為50 μM即1 mL培養(yǎng)基加入1 μL 50 mM的CCCP溶液），37℃ 孵育20 min。對于特定的細(xì)胞，CCCP的作用濃度和作用時(shí)間可能有所不同，需自行參考相關(guān)文獻(xiàn)資料確定。

3. 對于貼壁細(xì)胞（熒光顯微鏡或熒光酶標(biāo)儀的檢測流程）

（1）對于六孔板的一個(gè)孔，吸除培養(yǎng)液，根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)如有必要可以用PBS 或其它適當(dāng)溶液洗滌細(xì)胞一次，加入1 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。

（2）加入1 mL JC-1 染色工作液，充分混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20min。

（3）孵育結(jié)束后，吸除上清，加入1 mL 預(yù)冷的1×Assay Buffer（4℃左右洗滌效果較好），吸除上清，重復(fù)一次。

（4）加入2 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅，用熒光顯微鏡下觀察，也可以用熒光酶標(biāo)儀檢測。

注：①如果希望采用流式細(xì)胞儀檢測，染色前*行消化處理，將其制成細(xì)胞懸液，參考懸浮細(xì)胞的檢測方法。

②JC-1 染色并洗滌完成后盡量在30 min 內(nèi)完成后續(xù)檢測。在檢測前需冰浴保存。

4. 對于懸浮細(xì)胞（熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測流程）

（1）取5×10⁵ 個(gè)細(xì)胞，重懸于0.5 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液中，細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含血清和酚紅。

（2）加入0.5 mL JC-1 染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20 min。

（3）孵育結(jié)束后，1000 rpm 離心5 min，棄上清（注意盡量不要吸除細(xì)胞）。

（4）加入1 mL 預(yù)冷的1×Assay Buffer 重懸細(xì)胞（4℃左右洗滌效果較好），1000 rpm 離心5 min，去除上清，重復(fù)一次。

（5）再用適量預(yù)冷的1×Assay Buffer 重懸，用熒光顯微鏡觀察，也可以用流式細(xì)胞儀分析。

注：JC-1 染色并洗滌完成后盡量在30 min 內(nèi)完成后續(xù)檢測。在檢測前需冰浴保存。

5. 純化后的線粒體

(1)0.9 mL JC-1 染色工作液中加入0.1 mL 總蛋白量為10~100 μg 純化的線粒體。

(2)用熒光分光光度計(jì)或熒光酶標(biāo)儀檢測：混勻后直接用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行時(shí)間掃描(time scan)，

(3)激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為590 nm。如果使用熒光酶標(biāo)儀，激發(fā)波長不能設(shè)置為485 nm 時(shí)，可以在475~520 nm 范圍內(nèi)設(shè)置激發(fā)波長。

(4)用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察。

6. 結(jié)果分析

(1)流式細(xì)胞儀分析

對于正常細(xì)胞，在PE 或PI(FL2)通道可以檢測到線粒體內(nèi)的JC-1 紅色聚集物；對于凋亡細(xì)胞，在FITC(FL1)通道可以檢測到JC-1 綠色單體物。

(2)熒光顯微鏡分析

1)采用可以同時(shí)檢測熒光素和羅丹明，或者熒光素與Texas Red 的雙通道濾波器熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。

2)對于正常細(xì)胞，擁有完整的線粒體膜電位，線粒體在590 nm 處發(fā)出紅色熒光；對于凋亡或壞死的細(xì)胞，染料以單體形式存在，在530 nm處發(fā)出綠色熒光。

(3)熒光酶標(biāo)儀分析

1)紅色熒光：Ex/Em：550/600 nm；綠色熒光：Ex/Em：485/535 nm。

2)計(jì)算紅綠熒光比值：與正常細(xì)胞相比，在凋亡或壞死細(xì)胞中，紅綠熒光比值會(huì)降低。

注意事項(xiàng)

1.     本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。

2.     熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

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