Quick Cell 支原體快速檢測試劑盒(細胞培養)

產品描述

Quick Cell支原體快速檢測試劑盒(細胞培養)是專門用于快速檢測細胞培養上清或別的液體樣品(如血清)中是否存在支原體污染的試劑。本試劑盒操作簡單，反應時間短，只需吸取1 μl細胞培養上清加入反應體系中，60℃孵育1 h，肉眼觀察即可判定結果，與傳統檢測支原體的PCR法優勢明顯。本試劑盒檢測范圍廣，可以檢測：(1)M.Hyorhinis、(2)M.Fermentans、(3)M.Arginini、(4)M. hominis、(5)M. orale、(6)M. salivarium、(7)M.pirum、(8)Acholeplasma Laidlawii、(9)M. agalactiae、(10)M.bovis、(11)M. buccale、(12)M. arthritidis、(13)M. pulmonis等幾乎所有常見的污染細胞的支原體(M.為Mycoplasma的縮寫)。以上13種支原體約占細胞支原體污染的99%以上。絕大多數支原體污染集中于前8種。因此非常適合于與細胞生物學相關的科研實驗室及企業的日常支原體檢測。【注】：快速法不能檢測尿解，肺支原體。

訂購信息

產品組分

【注】：①本試劑盒所指50次測試包含陰性對照、陽性對照，并非50個樣品，因每次測試均需設置對照，測試樣品數根據實驗安排確定，理論上一次最多可測試48個樣品。②使用前用離心機輕微離心，以免管壁上粘附損失試劑減少檢測次數。（注：陽性支原體DNA無需離心。)

運輸與保存

藍冰運輸。-20℃保存，有效期36個月。

使用方法

1.待測細胞培養上清收集

　　為了準確判斷細胞是否有支原體的污染，待測的細胞培養液樣品最好來源于至少培養3 d且匯合度70-90%左右的細胞培養上清(貼壁細胞)。懸浮培養的細胞也需要在換液傳代后，至少讓細胞生長3 d再取培養液進行檢測，哺乳動物細胞的存在不會影響檢測結果。細胞培養上清可直接用于檢測，但樣品中如果含有EDTA等影響支原體DNA擴增的成分，建議進行樣品處理，處理過程如下：

樣品處理

(1)  根據濃縮倍數，可以取100-1500μL上述待測樣品到1.5 mL離心管內，在普通臺式離心機上1000 rpm低速離心5 min，將離心后的上清轉移到另一個離心管內，丟棄細胞沉淀。

(2)  將上清繼續13000 rpm（約 16000 g）高速離心 5 min，小心吸走全部上清，用 50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.5（樣品可以長期保存。推薦）或者去離子水重懸沉淀（沉淀中含有支原體），吹吸均勻（如果最初使用了1500 μL 的樣品，則支原體濃度大約提高了30倍）。

(3)  該重懸后的樣品可以直接檢測，也可以進行熱處理后再檢測（熱處理后，樣品保存更穩定）。熱處理過程：95 ℃加熱處理 5 min（可以轉移到 PCR 管內，在 PCR 儀上進行加熱處理），簡單離心（1000 g，5 sec）后，取上清進行檢測。【注】：收集的待測細胞培養液樣品如果不立即檢測，請放于-20℃或-80℃冰箱保存，不得放于室溫或4℃冰箱。樣品在-20℃至少可以保存1個月，在-80℃可以長期保存。此外，為了節約檢測成本，可以將不同時間收集的樣品放于-20℃或-80℃冰箱保存，而后一起檢測。

2.反應體系的配制

表1：恒溫反應體系的配制

(1)  將溶液Ⅰ、溶液Ⅲ從-20℃冰箱中取出，室溫放置待其融化，溶液Ⅱ從-20℃冰箱中取出后置于冰上備用。溶液Ⅱ、Ⅲ使用前各需1000rpm離心30 sec，用移液槍吹洗均勻。三種試劑按表1比例混合。

例：①如果待測樣品為8個（加上1個陰性和1個陽性對照），則樣品總數為10個。溶液1的總體積為21.5×10×1.06=227.90 μL。溶液2的總體積為1×10×1.06=10.60 μL。溶液3的總體積為0.5×10×1.06=5.3 μL。將溶液1、溶液2和溶液3混合均勻即可。

②如果打算一個試劑盒一次使用完畢，可以按照以下方法進行配制：直接往整管溶液1（1075 μL）中加入50 μL 溶液2和25 μL溶液3，混合均勻即可。如果一次使用完畢，一個試劑盒大概可以檢測48-49個樣品。

注：①總體積中多配制6%（如果覺得該比例不合適，可以自己調整），是為了防止移液誤差，以保證每個反應管中的反應液足量。

②溶液Ⅰ和溶液Ⅲ使用完后，請繼續放回-20 ℃冰箱中保存。

③溶液Ⅱ必須一直在-20 ℃冰箱中保存（溶液Ⅱ在-20 ℃不會凍住），不能放于室溫。

④溶液Ⅱ和溶液Ⅲ開蓋之前，請離心一下。

(2)  將上述配制好的恒溫反應體系，吹打均勻后，按每管 23μL分裝到0.2 mL的PCR管中。【注】：①盡量保證每管的反應液體積一樣。如果分裝時最后一管反應液不足，可以將其作為陰性對照管；②PCR管應該使用透明度良好的PCR管。

(3)  陰性對照管（Negative）可以加入 2μL滅菌水（自備，也可以不加）；往測試管（Test）中加入 2μL待測樣品；往陽性對照管（Positive）中加入 2μL陽性支原體DNA。反應液的總體積為 25μL。【注】：①裝有陽性支原體DNA的螺口管請不要高速離心，開蓋之前，只要用手指捏住，用力甩一下即可。吸取之前，請吹吸均勻后再吸取。如果不小心高速離心了，務必吹吸均勻后再吸取，否則陽性對照結果可能異常。②進行反應體系配制的房間，與樣品前處理、加陽性對照DNA、樣品DNA的房間最好分開。

3. 反應

PCR儀設置程序：61℃，60 min；10℃，forever；熱蓋溫度，105℃。【注】：若實驗室反應場所沒有PCR儀，可用水浴鍋代替，水浴鍋顯示溫度與實際溫度的溫差不超過0.5℃，另須往每個反應管內加入25μL礦物油，以防止水份揮發，然后蓋上蓋子，將反應管插入帶孔的漂板內，放入已經升溫到61℃的水浴內，準確反應60 min。

4. 結果判斷

61℃反應60 min后，立刻取出反應管，放于室溫。以一張白紙或白色泡沫盒為背景，通過反應管溶液顏色的變化，即可判斷檢測結果。如果溶液為藍綠色，則說明有支原體污染；如果為紫紅色，則說明沒有支原體污染(如圖1)。【注】：如果反應 60 min，陽性對照效果不明顯，可以繼續反應 10 min。

注意事項

1.       本產品僅限于科學實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領域。

2.       必須確保使用的移液槍本身沒有殘留的支原體，盡量用新購移液器、新開封的槍頭操作。整個操作過程，佩戴口罩，不要開口說話。由于本試劑盒非常靈敏，移液槍如吸附有，或者人為帶入支原體均有可能造成假陽性。

3.       最好使用帶濾芯的吸頭吸取溶液和陽性支原體等。如果沒有帶濾芯的吸頭，至少應該使用新開封的吸頭。

4.       檢測過程中，用過的各類吸頭、離心管務必小心處理，應裝入含有半瓶水的帶蓋的、可密封的垃圾瓶內。反應后的PCR管，不要開蓋，用過后將其用自封袋密閉，扔到遠離細胞房的獨立垃圾桶內。

5.       如果細胞被支原體污染，可以選購本公司或其他供應商提供的去除試劑盡早去除。

6.       如待測樣品是低溫保存的血漿、血清、臍帶血、胰酶、抗生素、未使用的培養液等，這類樣品中支原體含量較低，為了保證支原體DNA的檢出率，可通過離心濃縮提高樣品DNA濃度，再進行檢測。

7.       如果反應后，發現個別樣品的顏色介于陽性和陰性之間（正常這種情況應該概率很低，如果經常出現，樣品中可能含有可干擾正常指示效果的物質，必須先去除），可以將這些樣品繼續 61℃反應 10  min。10  min后，如果其顏色仍然與陽性對照的顏色不同，該樣品應該判為陰性。這種可疑樣品建議用相同試劑盒或者不同原理的其他試劑盒，如李記生物的Quick Cell PCR法支原體檢測試劑盒（貨號：AC16L064）、Quick Cell 發光法支原體檢測試劑盒（貨號：AC16L062）、Quick Cell探針法支原體檢測試劑盒（貨號：AC16L068）進行復檢。

8.       反應后，請勿打開反應管的蓋子，否則有可能造成檢測環境的污染。

表2：Quick Cell 支原體快速檢測試劑盒(細胞培養專用)的優勢

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