Super SYBR Green qPCR Master Mix

Super SYBR Green qPCR Master Mix是一款用于實(shí)時(shí)定量PCR的即用型試劑盒。其中Super SYBR Green是一種新型的專(zhuān)門(mén)為qPCR和高分辨率溶解曲線分析設(shè)計(jì)的DNA結(jié)合染料，它通過(guò)一種“按需求釋放”的機(jī)制，極大地降低了對(duì)PCR擴(kuò)增抑制性。包含一種化學(xué)修飾的熱啟動(dòng)Taq DNA多聚酶。這種Taq酶2分鐘內(nèi)可以被*激活，尤其適用于快速PCR反應(yīng)。此外，這種Taq DNA多聚酶在室溫下沒(méi)有活性，不會(huì)對(duì)DNA造成污染，性能遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于市面上抗體修飾的熱啟動(dòng)酶。Super SYBR Green的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它的安全性。常規(guī)的DNA結(jié)合染料存在潛在的致突變性。基于這方面考慮，我們研發(fā)設(shè)計(jì)了Super SYBR Green染料，它不能透過(guò)細(xì)胞膜，因而不能與活細(xì)胞的基因組DNA結(jié)合，確保了其安全性。然而，其他所有的商業(yè)性PCR熒光染料都可以在幾分鐘內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞，例如SYBR Green I，是一種環(huán)境毒性接近溴化乙錠（EB）的誘變劑。

此外，Super SYBR Green qPCR Master Mix還有一個(gè)非常突出的優(yōu)點(diǎn)，即它的PCR產(chǎn)物可以直接用于凝膠電泳檢測(cè)，不需要額外添加任何核酸染料。試劑盒中的Super SYBR Green可以作為DNA預(yù)染的核酸染料，電泳后可以直接用于觀察DNA條帶。光譜特性：Ex/Em: 500/528nm，常規(guī)的凝膠成像系統(tǒng)，不需要做任何調(diào)整。

試劑盒組成

使用方法

1.實(shí)驗(yàn)參考因素

1）如果使用玻璃毛細(xì)管進(jìn)行反應(yīng)（Roche LightCycler用戶部分實(shí)驗(yàn)用到），那么需要在反應(yīng)體系中額外加入BSA（終濃度 ～0.5 mg/mL）；如果使用透明的塑料毛細(xì)管，則不需要添加BSA。

2）溶解曲線分析儀器：Rotor-Gene 6000, ABI 7500 ,HR1™, 384-well LightScanner™, Roche LightCycler 480,Rotor-Gene 6000, ABI 7500 和Roche LightCycler480等儀器都可以用于qPCR和溶解曲線的分析。具體參照儀器生產(chǎn)商的使用說(shuō)明進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集和分析操作。

3）ΔR 和 ΔRN：當(dāng)比較眾多qPCR Master Mix產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度時(shí)，需要注意比較的方法。通常ΔR是高于基線水平的熒光增量。一般來(lái)說(shuō)，10 μL 的 1× Super SYBR Green反應(yīng)體系與50 μL ABI公司的1×PowerSYBR 或Invitrogen公司的1×SYBR Green I相比，可以產(chǎn)生更高的ΔR。ΔRN定義為ΔR除以ROX值。因此高濃度的ROX可以產(chǎn)生更低的ΔRN。當(dāng)ROX被ABI 7500, iCycler IQ, MJ opticon, MJChromo4, MX3000或MX4000儀器zui大激發(fā)時(shí)，ΔRN會(huì)更小。因此，應(yīng)用于商業(yè)SYBR Green Master Mix的較低濃度的ROX往往會(huì)產(chǎn)生更高的ΔRN。

4）預(yù)期的動(dòng)力學(xué)曲線：根據(jù)對(duì)比實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)， Super SYBR Green Master Mix的PCR擴(kuò)增曲線與SYBR Green I的MasterMix相比，其靈敏度和穩(wěn)定性更高。由于SYBR 染料對(duì)DNA擴(kuò)增的抑制性影響，基于SYBR染料的Master Mix在PCR達(dá)到Ct閾值后通常會(huì)延遲擴(kuò)增5-7個(gè)循環(huán)數(shù)。相比較而言，SuperSYBR Green Master Mix可以使PCR持續(xù)擴(kuò)增至50個(gè)循環(huán)。

5）Ct值：在相同條件下，使用Super SYBR Green和SYBR Green I進(jìn)行的qPCR反應(yīng)，其Ct值相對(duì)誤差在+1或-1之間。

6）擴(kuò)增片段長(zhǎng)度：為了使SYBR Green qPCR Master Mix的擴(kuò)增效率達(dá)到*，推薦的DNA擴(kuò)增長(zhǎng)度為50-200 bp，如果需要擴(kuò)增更長(zhǎng)的DNA片段，那么需要適當(dāng)延長(zhǎng)PCR的反應(yīng)時(shí)間。

7）凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物：當(dāng)使用Super SYBR Green MasterMix進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)后，如需進(jìn)行DNA凝膠電泳分析，只要在PCR反應(yīng)溶液中加入DNA loading buffer，按常規(guī)程序上樣，跑電泳，不需要在制膠時(shí)額外添加核酸染料。使用254 nm UV激發(fā)器、凝膠成像儀，或SYBR Green濾光器可以直接觀察凝膠。另外，凝膠也可以用488nm 的激光凝膠掃描儀進(jìn)行觀察。

2.PCR反應(yīng)體系

每管反應(yīng)組分如下表所示(供參考)

注：1）cDNA模板：SYBR Green qPCR Master Mix適用于mRNA的定量分析。*步通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄將mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，第二步利用Super SYBR Green kit進(jìn)行cDNA的定量擴(kuò)增。為了確保擴(kuò)增效率，cDNA樣品的體積不要超過(guò)總反應(yīng)體積的10%。為了定量轉(zhuǎn)錄水平，我們推薦使用no-RT的對(duì)照樣品，以排除可能的基因組DNA的污染。

注：2）一步法RT-qPCR用于mRNA的定量分析。首先引物設(shè)計(jì)時(shí)要盡量避免形成引物二聚體。我們建議合理優(yōu)化逆轉(zhuǎn)錄酶的使用量和逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程的持續(xù)時(shí)間。耐熱的逆轉(zhuǎn)錄酶可以兼容Agilent, Fermentas, Lucigen和Life Technologies等各種儀器。如果可以，設(shè)計(jì)的引物Tm值盡量在55℃左右，逆轉(zhuǎn)錄及后續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)也應(yīng)在55℃。為了定量轉(zhuǎn)錄水平，我們推薦使用no-RT的對(duì)照樣品，以排除有可能的基因組DNA的污染。

注：3）模板濃度：DNA模板依照不同需求，其反應(yīng)量也有所不同。推薦的基因組DNA的模板量范圍是50 pg-50 ng，推薦的cDNA 的模板量范圍是50fg-50pg。

注：4）參照染料ROX：對(duì)于某些固定型號(hào)的儀器，必須添加ROX才能測(cè)定Ct值。ROX的使用濃度可以參照表1（見(jiàn)第4頁(yè)）。ROX會(huì)給熔解曲線分析造成一定的背景干擾。因此，為了避免ROX雜峰干擾，在應(yīng)用軟件的“Passive Reference Dye”中不要選擇檢測(cè)ROX熒光值選項(xiàng)，然后再進(jìn)行數(shù)據(jù)的收集與分析。

3.反應(yīng)程序設(shè)置

您可以根據(jù)擴(kuò)增模板的性質(zhì)和儀器的功能，選擇以下三個(gè)程序之一進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

A．兩步快速擴(kuò)增法

這個(gè)程序適用于大多數(shù)引物Tm為60℃的擴(kuò)增，溶解曲線遵循您所用儀器提供的標(biāo)準(zhǔn)流程執(zhí)行。

注：5）變性時(shí)間：如果擴(kuò)增片段較短，變性時(shí)間可以低于5 s，甚至可以低至0 s。當(dāng)變性時(shí)間設(shè)置為“0”時(shí)，它僅僅意味著溫度增加到96℃，然后沒(méi)有停留迅速降溫。設(shè)置時(shí)間5 s可以確保DNA較長(zhǎng)片段和高GC片段的變性。高性能的儀器會(huì)進(jìn)一步增加擴(kuò)增子變性的可靠性。

B . 三步擴(kuò)增法

這個(gè)程序適用于擴(kuò)增溫度比退火溫度高的實(shí)驗(yàn)。例如，如果擴(kuò)增片段有相對(duì)較長(zhǎng)的引物，容易產(chǎn)生非特異性的擴(kuò)增，在更高的溫度下進(jìn)行延伸可以降低非特異性擴(kuò)增。溶解曲線遵循您所用儀器提供的標(biāo)準(zhǔn)流程執(zhí)行。

注：6）退火溫度：退火溫度應(yīng)根據(jù)引物Tm值設(shè)定，通常是50 -60℃為佳。不過(guò)，引物Tm值（和擴(kuò)增溫度）應(yīng)該設(shè)計(jì)盡可能地接近60℃（但仍在50 - 60℃范圍內(nèi)），減少退火和變性溫度之間的差距。這樣溫度增加所需時(shí)間更少，進(jìn)而擴(kuò)增效率更高。

注：7）擴(kuò)增溫度：擴(kuò)增溫度設(shè)定在72℃對(duì)于大多數(shù)擴(kuò)增子通常效率更高。然而對(duì)于富含AT的擴(kuò)增片段（> 70%）或含有AT富集補(bǔ)丁的擴(kuò)增子，60℃延長(zhǎng)通常可以獲得更好的結(jié)果。

C．通用程序

此程序適用于幾乎所有qPCR儀器，也適用于使用快速擴(kuò)增法無(wú)法達(dá)到較好效果的擴(kuò)增子。

表1、根據(jù)PCR儀種類(lèi)不同，推薦ROX使用濃度