PikoGreen dsDNA quantitation reagent(優于PicoGreen)

產品描述

PikoGreen是一種極為靈敏的雙鏈DNA熒光染料，于雙鏈DNA的定量。測定DNA濃度在cDNA文庫構建、DNA亞克隆、PCR產物估測等領域中非常重要，另外疫苗等生物制品中殘留微量DNA的檢測因關系人身健康，顯得尤為重要。

相比傳統的方法，Pikogreen dsDNA Quantitation Reagent定量具有以下優勢：①靈敏：數量級較UV吸光讀數更敏感，可節省樣品；②特異性強：只結合dsDNA，特異性強，不受樣品常規污染影響。傳統紫外吸光法容易受樣品中存在的單鏈DNA，蛋白，RNA等影響；③耐受性好：耐受較高濃度的鹽、尿素、乙醇、CHCl?、去垢劑、蛋白或瓊脂糖，可以直接定量PCR擴增產物而無需從反應混合物中純化DNA。④線性范圍寬：PikoGreen dsDNA染料測定DNA濃度，在100pg/ml-100ng/ml范圍內呈良好線性；熒光計兼容。⑤容易使用：在樣品中加入染料，等待5-6分鐘染色，然后讀數即可，且適用于96和384孔板；與大多數基于熒光的酶標儀和可適用于各種DNA樣品分析，PCR的分析、芯片樣品、DNA損傷分析、酶活性分析、基因組DNA定量以及復雜混合物中dsDNA的檢測和病毒DNA定量等多種領域。

PikoGreen僅與DNA雙鏈結合后才發出熒光，且所產生的熒光與DNA濃度呈正比，在存在ssDNA、RNA和單體核苷酸的條件下，可以選擇性地檢測低至25pg/ml的dsDNA。該分析在四個數量級范圍內呈線性，且幾乎無序列依賴性，可以地測量多個來源的DNA，包括基因組DNA、病毒DNA、小量提取DNA或PCR擴增產物。該方法因其穩定性、靈敏性，已經錄入《中國藥典》。

使用96孔板檢測，每次使用量200µl，則1ml PikoGreen定量試劑可以做2000次分析。PikoGreen以每管1ml的形式提供，Cat#D1101L1123。另外，李記生物特別研發了【Pikogreen dsDNA定量檢測試劑盒（Cat# D1101L1123）】方便客戶選用。

運輸和保存方法

常溫運輸。4℃避光干燥保存，有效期6個月。

使用方法

1. PikoGreen工作液的配制

使用前將PikoGreen dsDNA定量試劑回溫至室溫；PikoGreen是以100µL 200×的濃縮液形式保存于無水DMSO中的（共10管），實驗當天，根據實驗需求用1×TE按1:200 的比例稀釋適量定量試劑濃縮液。例如要準備足夠的操作溶液以2ml檢測體系測定20個樣品，可向19.9mL 1×TE 中加入100μL PikoGreen dsDNA 定量試劑。工作液見光易降解，盡量在配好后幾小時內使用。

2. 配制標準品DNA溶液

1) 用1 X TE溶液溶解dsDNA制備1μg/mL dsDNA 。根據在1cm 光程長度的比色杯中A260nm時的吸光度確定DNA 濃度；相應于1μg/mLdsDNA 溶液A260=0.02。標準液常用小牛胸腺DNA制備，PikoGreen 試劑測定法在通常污染核酸制劑的幾種復合物存在的條件下仍能保持線性良好，但是，為了得到有效的對照處理，被用來做標準曲線的dsDNA 溶液要用和實驗樣品相同的方式來處理，并且應該包含相同的可能存在的污染物。

2) 制備從0.5ng/mL 到500ng/mL（見表1）單重復8 個點的標準曲線。配制一系列的標準DNA 溶液，然后與等體積的PikoGreen 工作液混和，放入1 x 1cm 比色杯中?；旌舷嗤w積的1 x TE 和PikoGreen 操作溶液作為空白對照,避光于室溫下放置2-5 分鐘。

表1: 用1 x 1cm 比色杯時DNA 標準濃度配制參考

3) 當用微量檢測皿適配器時，PikoGreen 測定也可在較低的測定體積（50μL 到200μL）內完成。產生從1ng/mL 到100ng/mL（見表2）的標準曲線，配制一系列的標準DNA 溶液，然后與等體積的PikoGreen 工作液混和，將至少50μL 溶液轉移到微量檢測皿中。確信不要在樣品中引入氣泡，輕輕地彈微量檢測皿的外部經?？梢则屔馀?。避光于室溫下放置2-5 分鐘。

表2：用微量檢測皿DNA 標準濃配制參考

4) 孵育后用合適的熒光計測量樣品熒光值。Ex/Em=480nm/520nm，為了減少光漂白，應保持所有樣品的檢測時間一致。用熒光值zui大的樣品校正儀器。

5) 用檢測數據與DNA標準溶液濃度做回歸分析，制作標準曲線。

3. 樣品分析

1) 用1 x TE 稀釋待測DNA 樣品至需要的體積（1x1cm 比色杯需1.0mL，微量檢測皿需25-100μL）。對樣品高度稀釋可以確保任何污染物都被zui大限度地沖淡。然而，也要避免取樣體積太小而無法吸取的情況。

2) 在每個樣品中加入等體積PikoGreen 工作液，混合好，將混合物移入合適的比色杯，避光于室溫下放置2-5 分鐘。

3) 檢測、讀取熒光值，換算樣品中dsDNA濃度。可以對樣品進行不同的稀釋處理重復測定以確保結果的準確性。

注意事項

1) PikoGreen定量試劑含有DMSO，PikoGreen 是結合dsDNA，操作時采取適當防護，戴手套小心操作；

2) 盡管常見污染物不會影響PikoGreen 檢測dsDNA濃度（見PikoGreen耐受污染物列表），但是當樣品中dsDNA濃度太低，RNA, ssDNA濃度超過dsDNA 10倍以上時，RNA, ssDNA等污染還是會對檢測結果產生較大干擾，在此種情況下，RNA 酶可以消除RNA干擾, RNA 酶A、酶T1 、核酸酶S1 結合能除去ssDNA干擾，從而保證樣品熒光值是由dsDNA 產生。

附表：Pikogreen定量耐受的污染物列表

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